第195期：饲料中添加纳米硒能够减轻高脂饲料对草鱼幼鱼肠道的损伤：从肠道形态、紧密连接、炎症、
论文ID
原名：Dietary nano-selenium alleviated intestinal damage of juvenile grass carp （Ctenopharyngodon idella）induced by high-fat diet: Insight from intestinal morphology, tight junction, inflammation, anti-oxidization and intestinal microbiota
译名：饲料中添加纳米硒能够减轻高脂饲料对草鱼幼鱼肠道的损伤：从肠道形态、紧密连接、炎症、抗氧化和肠道菌群等方面的研究
作者：Sha Liu a, Haibo Yu a,*, Pengju Li a, Chi Wang a, Guohao Liu a, Xiaotian Zhanga,Cheng Zhang a, Meng Qi b, Hong Ji a
完成单位：
a College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling, 712100, China
b Key Laboratory of Se-enriched Products Development and Quality Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Ankang, 725000, China
期刊：Animal Nutrition
影响因子：4.492
发表时间：2021-07-11
1、摘要
近年来，高脂饲料（HFD）在水产养殖中广泛应用，降低了养殖鱼类的肠道健康。本研究探讨了纳米硒对HFD饲喂草鱼幼鱼肠道健康的保护作用。135尾试验鱼分别饲喂常规饲料（CON）、高脂饲料（HFD）和添加0.6 mg/kg 纳米硒（HSe）的高脂饲料（HFD）10周。
结果表明，饲粮中添加纳米硒显著提高了HFD降低的草鱼幼鱼存活率和饲料利用率（P < 0.05）。添加纳米硒（0.6 mg/kg）可以缓解HFD对肠道的损伤，从而维持肠道的完整性。此外，还能显著上调受HFD抑制的草鱼幼鱼肠道紧密连接相关基因（ZO-1、claudin-3和occludin）、抗氧化相关基因（GPx4a和GPx4b）以及ZO-1蛋白的表达（P<0.05）。此外，纳米硒显著抑制了HFD诱导草鱼幼鱼肠道炎症相关基因的表达，包括炎症因子（IL-8、IL-1b、IFN-g、TNF-a和IL-6）、信号分子（TLR4、p38 MAPK和NF-kB p65）以及NF-kB p65和TNF-a的蛋白表达（P < 0.05）。此外，饲粮中添加纳米硒可通过增加梭状杆菌等有益菌群的丰度，缓解HFD引起的草鱼幼鱼肠道菌群失衡。最后，饲粮中添加纳米硒增加了肠道短链脂肪酸（SCFA）的生成，尤其是丁酸和己酸，与肠道通透性和炎症反应的增加呈负相关。综上所述，高脂饲料（HFD）中添加纳米硒（0.6 mg/kg）可通过改善肠道屏障功能、减轻肠道炎症和氧化应激，有效减轻草鱼幼鱼肠道损伤。这些积极作用可能是由于纳米硒对肠道菌群的调控和以及有益的短链脂肪酸（SCFA）水平的增加。
2、试验设计
3、结果与分析
表1：基础饲粮组成，常规饲粮（Con）和高脂饲粮（HFD）（g/kg，风干基础）。
表2：引物序列
3.1 生长性能
图1：饲粮纳米硒对饲喂高脂饲料的草鱼幼鱼生长性能的影响。（A）SGR=比增长率；（B）FI=采食量；（C）FCR=饲料转化率；（D）SR=存活率；数值表示为平均值±SD（n=3）。a、b不同字母表示显著差异（P<0.05）。
饲粮中纳米硒对草鱼幼鱼SGR、FI、FCR和SR的影响如图1A、B、C和D所示。与常规饲粮相比，高脂饲粮显著降低了草鱼幼鱼SGR和SR，提高了FI和FCR (P < 0.05)。与HFD相比，添加纳米硒显著提高了草鱼幼鱼的SR，降低了FCR (P < 0.05)。然而，HSe和Con组草鱼幼鱼的SR和FCR没有显著变化(P > 0.05)。
3.2 肠道形态学
图2：饲粮中添加纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道形态的影响。VH=绒毛高度； VW=绒毛宽度；CD=隐窝深度；MT=肠上皮肌厚度；箭头表示杯状细胞。圆圈代表肠粘膜脱落。三角形代表肠绒毛脱落。五角星代表肠绒毛粘连。
图3：饲粮中添加纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道形态参数的影响。VH=绒毛高度； VW=绒毛宽度；
通过观察肠道微观结构，研究纳米硒对草鱼幼鱼肠道形态和功能的影响（图2和图3）。与对照组相比，HFD组肠绒毛结构紊乱，出现肠绒毛萎缩、肠绒毛粘连和肠绒毛脱落。相比之下，在HFD中添加纳米硒可以有效缓解上述肠道损伤（图2）。与HFD组相比，HSe组和对照组的肠上皮细胞排列紧密有序，存在明显的间隙（图2）。与常规饲料相比，HFD显著降低了草鱼幼鱼的肠绒毛高度（VH）和宽度（VW）。然而，与HFD组相比，饲粮中添加纳米硒使VH更高（P < 0.05），VW更长（P < 0.05）（图3A和B）。
3.3 紧密连接、炎症和抗氧化相关基因和蛋白的表达
图4所示。饲粮纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道紧密连接蛋白mRNA表达的影响。（A）ZO-1；（B）occludin；（C）claudin-3。
图5：饲粮中添加纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道紧密连接蛋白（ZO-1）表达的影响。
图6：饲粮中纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道炎症因子mRNA表达的影响。（A）TLR2;（B）TLR4;（C）P38 MAPK;（D）NF-kB p65;（E）IL-8;（F）IL-1β;（G）IFN-γ;（H）TNF-α;（I）IL-6。
图7：饲粮中添加纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道炎症因子蛋白表达的影响。
图8所示：饲粮中纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道Hif-1a mRNA表达的影响。
图9：饲粮中纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道GPx4a和GPx4b表达的影响。
首先，如图4所示，HFD显著降低了肠道紧密连接蛋白基因的表达，包括ZO-1（图4A）、occludin（图4B）和claudin-3（图4C）（P < 0.05）。与HFD相比，饲粮中添加纳米硒显著提高了ZO-1、occludin和claudin-3 mRNA表达量（P < 0.05）。与常规饲粮相比，高脂日粮组ZO-1蛋白表达水平显著降低。饲粮中添加纳米硒显著提高了ZO-1蛋白表达水平（图5,P < 0.05）。
其次，如图6所示，由于HFD, TLR4（图6B）、P38 MAPK（图6C）、NF-kB P65（图6D）、IL-8（图6E）、IL-1β（图6F）、IFN-γ（图6G）和TNF-a（图6H）的mRNA表达水平显著升高（P < 0.05）。然而，添加纳米硒显著降低了TLR4、P38 MAPK、NF-kB P65、IL-8、IL-1β、IFN-γ、TNF-a和IL-6的mRNA水平（图6I）（P < 0.05）。同时，如图7所示，较Con组相比，HFD组NF-kB P65、TNF-a蛋白表达水平明显升高，HSe组明显降低（P < 0.05）。
与常规饲粮相比，HFD显著提高Hif-1a mRNA水平（图8）（P < 0.05）。与HFD组相比，纳米硒显著降低了Hif-1a mRNA表达水平（P < 0.05）。
最后，如图9所示，HFD饲喂草鱼幼鱼肠道中GPx4a和GPx4b mRNA表达量显著降低（P < 0.05）。HSe组显著诱导草鱼幼鱼肠道GPx4a和GPx4b mRNA表达。
3.4 肠道菌群
图10：饲粮中添加纳米硒对高脂饲料草鱼幼鱼肠道菌群α和β多样性的影响Alpha多样性以（A）观测种指数、（B）Chao-1指数和（C）Shannon指数评价。（D）采用非度量多维尺度（NMDS）评估Beta多样性（n=3）。
图11：饲粮纳米硒对饲喂高脂饲料（HFD）的草鱼幼鱼肠道微生物群落门（A）和属（B）水平下物种组成的影响（n=3）。
利用Illumina MiSeq平台对细菌16s rDNA的V4和V5区进行扩增和测序，以评估纳米硒对肠道菌群组成的影响。经筛选，9份样品（每组3份重复样品）均获得至少70932份良好序列。对其进行聚类以生成操作分类单元（OTU），在所有样本中总共观察到720个OTU。如图10A、B、C所示，与C组相比，H组观察到的物种和反映物种丰富度和多样性的Chao-1指数减少，Shannon指数也减少。如图10D所示：并采用非度量多维尺度（NMDS）分析beta多样性，相比之下，添加纳米硒（0.6 mg/kg）的HFD增强了草鱼幼鱼肠道菌群的丰富度和多样性（图10A、B和C）。纳米硒组（HSe）与HFD组分开聚集，其微生物区系与Con组相似。
Con组、HFD组和HSe组草鱼幼鱼的门和属水平肠道菌群组成如图11A和B所示。大部分肠道菌群属于变形菌门（31.03%、21.31%和16.14%）、梭菌门（10.12%、3.49%和34.46%）、放线菌门（16.87%、12.12%和1.89%）、氯菌门（18.28%、19.02%和3.03%）、扁平菌（11.29%、11.06%和10.13%）、拟杆菌门（1.07%、19.42%和11.29%）、厚壁菌门（4.80%、12.03%和9.70%）、Con、HFD和HSe组中衣原体（3.61%、1.12%和1.21%）、疣状菌（2.62%、0.28%和2.07%）。
另一方面，在属水平上，与常规饲粮相比，HFD降低了鲸目杆菌、莱弗索尼亚菌和倍耐力卢拉菌的比例。相反，拟杆菌属（Bacteroides）、芽杆菌属（Gemmobacter）和真菌属（Planctomyces）的比例高于Con组，且饲粮中纳米硒干预逆转了上述所有变化（图11 B）。
3.5 短链脂肪酸的浓度
图12：高脂饲料中添加纳米硒对草鱼幼鱼肠道短链脂肪酸浓度的影响。（红色，高浓度；绿色，低浓度）（n=3）。
如图12所示，3组检测到的6种短链脂肪酸中，乙酸、丙酸和丁酸的浓度最高。与普通饲料相比，高脂饲料降低了6种短链脂肪酸的浓度。而纳米硒在HFD中增加了乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和己酸的浓度水平，降低了丙酸的浓度水平。
3.6 肠道菌群丰度与短链脂肪酸水平的相关性
图13：肠道菌群丰度（属水平）与短链脂肪酸水平相关性的Heatmap图。颜色的强度代表关联的程度（红色,正相关；蓝色,负相关）。
肠道菌群丰度（属水平）与SCFA水平之间的Spearman相关性热图如图13所示。Cetobacterium与异丁酸、己酸呈极显著正相关，Planctomyces与Alpinimonas呈极显著负相关（P < 0.01）。Pirellula、Nocardioides、Meganema、Luteolibacter的丰度与丁酸呈显著正相关。
4 结论
本研究探讨了日粮中添加纳米硒对草鱼高脂日粮引起的肠道损伤的缓解作用。综上所述，高脂日粮中添加纳米硒（0.6 mg/kg）可有效保护草鱼幼鱼肠道，改善肠道屏障功能，减少肠道炎症和氧化应激，从而提高草鱼幼鱼的存活率和饲料利用率。这些积极作用可能是由于纳米硒对肠道菌群的调控和增加的有益短链脂肪酸水平。
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