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原名：Effects of the Inclusion of Fermented Mulberry Leaves and Branches in the Gestational Diet on the Performance and Gut Microbiota of Sows and Their Offspring
译名：日粮中添加发酵桑叶和桑枝对妊娠期母猪及其后代生产性能和肠道菌群的影响
作者：Yuping Zhang1,2, Chang Yin1, Martine Schroyen2, Nadia Everaert2, T eng Ma1,* and Hongfu Zhang1
完成单位：1State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; zhangyuping@caas.cn (Y .Z.); 82101186178@caas.cn (C.Y .); zhanghongfu@caas.cn (H.Z.)
2Precision Livestock and Nutrition Laboratory , TERRA Teaching and Research Centre,Gembloux Agro-Bio Tech, University of Liège, 5030 Gembloux, Belgium; martine.schroyen@uliege.be (M.S.);nadia.everaert@uliege.be (N.E.)
*Correspondence: mateng@caas.cn; Tel.: +86-130-2198-3772
期刊：Microorganisms
影响因子：4.152
发表时间：2021-03-15
1、摘要
发酵饲料桑树（FFM），富含膳食纤维，添加到母猪饲粮中的作用尚未被充分评估。本试验研究了日粮中添加25.5% FFM对妊娠期母猪及其后代生产性能和肠道微生物群的影响。试验将40头经产母猪(约克夏×长白猪；胎次3–7(SEM= 4.4±0.3)随机分配到两个处理组，每组20头，每头母猪及其产仔作为一个生物重复。在对照组中，母猪饲喂玉米-豆粕型日粮，而在FFM组中，妊娠日粮中添加25.5% FFM（活菌的总浓度为1.3×105个/克）替代25.5%的玉米-豆粕型日粮。
试验结果表明，妊娠期第60天，FFM组血清葡萄糖、孕酮和雌二醇浓度不受饲粮处理的影响，而血清胰岛素和粪便短链脂肪酸水平均降低（G60，p< 0.05）。此外，FFM增加了自由采食量和断奶窝重（p< 0.05），同时减少了哺乳期间背脂厚度和体重的损失（p< 0.05）。16S rRNA测序显示，FFM添加显著增加了G60母猪粪便微生物群的多样性和相对丰度（p< 0.05）。FFM组母猪的微生物区系差异表现为拟杆菌在G60日龄时增加，而厚壁菌在泌乳第7天时减少（L7，p< 0.05），而FFM仔猪的差异表现为L0 unclassized-f -Lachnospiraceaeon 和 L7 NORANK-f -Ruminococcaceaeon均增加（p< 0.05）。简而言之，FFM可以被认为是母猪日粮中一种潜在的饲料成分。
2、试验设计
3、结果与分析
表1：母猪日粮和含FFM饲料的组成、营养价值及妊娠饲喂处理
图1：两个处理组母猪及其仔猪在妊娠期和哺乳期的时间表、不同样本的数量和指数
G0、G20、G60和G110分别代表妊娠天数0、20、60和80天。L0、L1、L3、L7、L14和L21分别代表泌乳天数0、1、3、7、14和21。BF=背脂；BW=体重；VFI=自由采食量。每个样本的编号显示为nCON/nFFM。
3.1 母猪的繁殖性能
图2：添加FFM对母猪繁殖性能的影响
(A) 哺乳期每日自由采食量，（n=10）。(B)G0、G20、G60、G110和L21背脂厚度(n=20)。(C)G110和L21体重(n=10)。(D)出生时和断奶第21天的产仔数。(E)出生时和断奶第21天的窝重。(F)初生仔猪和断奶第21天的平均重量。母猪出生时分别为CON(n=17)和FFM(n=20)，断奶时分别为CON(n=16)和FFM(n=15)。(G)CON组(n=33)和FFM组(n=34)断奶和发情间隔。CON代表对照饮食。FFM代表日粮中含有25.5%的发酵饲料桑椹。
*代表p<0.05，**代表p<0.01。
如图2所示，饲粮中添加FFM，整个泌乳期的自由采食量(VFI)显著增加，主要是在L1、L3和L21(p<0.05，图2a)。在妊娠第0、20、60或110天，FFM组和CON组的背脂厚度(BF)没有差异(p>0.05，图2b)。在整个泌乳期，FFM组母猪的体脂和体重损失显著低于CON组(p<0.05)，CON组和FFM组L21的BF值(cm)分别为20.45±0.68和18.85±0.39(p < 0.05)。FFM组母猪体重(Kg)的损失显著低于CON组(CON组32.58±2.68 VS. FFM组23.20±2.64；p<0.05，图2f)。
3.2 血清葡萄糖和激素浓度、初乳中的成分和粪便中的可溶性细胞因子
图3：添加FFM对葡萄糖、激素和粪便中SCFAs的影响
测定CON(n=16)和FFM(n=15)母猪血清中葡萄糖(A)、孕酮(B)、胰岛素(C)和雌二醇(D)的浓度。初乳成分(E) CON(n=14)和FFM(n=16)。粪便中短链脂肪酸(SCFA)浓度(n=8)(F)。
G0、G20和G60代表妊娠0、20和60天。CON代表对照饮食。FFM代表日粮中含有25.5%的发酵饲料桑椹。Tms为乳固形物总浓度。
*代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05。
血清和初乳评估结果显示，FFM添加影响胰岛素水平和初乳成分(图3)。妊娠期饲粮处理对母猪血清葡萄糖(图3a)、孕酮(图3b)、雌二醇(图3c)和胰岛素(图3d)浓度无明显影响，但妊娠60d时FFM母猪的血清胰岛素水平显著低于对照组母猪(p<0.01)。在G60，20头FFM母猪粪便中的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸等6种单链脂肪酸(F)的含量均显著低于对照母猪(p<0.01)。结果表明，FFM母猪粪便中的游离脂肪酸(F)含量极显著低于对照母猪(p<0.01)，其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量极显著低于对照母猪(p<0.01)。
与CON组相比，FFM组初乳中的乳蛋白(p=0.07)、脂肪(p=0.24)和乳糖(p=0.24)浓度没有受到FFM处理的影响，而FFM组猪的乳固形物总量(p<0.05，图3e)和不含脂肪的乳固形物浓度(p<0.05，图3e)显著低于CON组猪(p<0.05，图3e)。FFM组仔猪在断奶期间的体重显著增加(图1f；p<0.05)。FFM母猪的体重指数有延长的趋势(FFM的平均日龄为7.35±1.14天，CON的平均日龄为6.73±1.03天，图1g；p>0.05，图3f)。CON组母猪妊娠期便秘发生率为21.05%，FFM组为0%，哺乳期第1周，CON组母猪便秘发生率高达47.06%。而FFM组仍为0%。从第3天到第10天，13.3%的CON仔猪出现腹泻，而FFM组的仔猪没有腹泻。
3.3 粪便微生物区系
3.3.1 母猪粪便微生物区系组成
表2：G60和L7母猪粪便的α多样性
图4：粪便微生物群PCoA图
通过主坐标分析(PCoA)确定OTU水平下，母猪粪便微生物群对G60和L7 (a)的未加权均匀性值和仔猪粪便微生物群对L0和L7 (b)的未加权均匀性值显示添加FFM的效果。
PCoA采用Bray-Curtis方法，不同的颜色或形状代表不同组的样品。两个样本点越接近，两个样本的物种组成越相似。每组每个阶段N = 7。
G60SCON=G60日龄的CON母猪；G60SFFM=G60日龄的FFM母猪；L7SCON=L7日龄的CON母猪；L7SFFM=L7日龄的FFM母猪；L0PCON=L0日龄的CON仔猪；L0PFFM=L0日龄的FFM仔猪；L7PCON=L7日龄的CON仔猪；L7PFFM=L7日龄的FFM仔猪。
粪便微生物区系的α多样性(SOBS、Chao1和ACE)和多样性指数(Shannon和Simpson)如表2所示。在G60时，与CON组相比，FFM组的SOBS、ACE和Chao1指数显著升高，Simpson指数显著降低(p<0.05)。在L7，CON组和FFM组在测量的大多数指标上没有差异。母猪和仔猪的良好覆盖率均在97%以上，表明本研究捕捉了优势种系型。未加权的均匀性度量用于测量β多样性，距离通过主坐标分析可视化(PCoA，图4a)。结果表明，不同处理组母猪的微生物群落在G60日龄存在差异，但在L7日龄没有明显的区别。
表3：G60和L7母猪粪便微生物区系在门、属水平上的组成
在G60和L7比较了饲喂CON和FFM日粮的母猪粪便微生物区系组成的差异（表3）。两个处理组猪的优势菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门和变形杆菌，占各处理组总类群的90%以上。G60时，FFM组拟杆菌门的相对丰度显著高于CON组(p<0.05，q>0.05)。L7时，当各组饲喂相同的不含FFM的泌乳日粮时，FFM组母猪粪便中厚壁菌门的相对丰度低于CON组(p<0.05，q>0.05)。G60样本中，厚壁菌门中，FFM组Ruminococcaceae_NK4A214_group； Ruminococcaceae_UCG005;Family_XIII_AD3011_group;Ruminococcaceae_UCG-013和Lachnospiraceae_AC2044_group等五个菌群浓度较对照组高。与对照组相比，在拟杆菌门中，FFM组中Prevotellaceae_UCG-001浓度增加，而Parabacteroides浓度减低。L7样本中，FFM组中Prevotellaceae_NK3B31_group和norank_f_p-2534-18B5_gut_group两种菌群较对照组显著增加，Family_XIII_AD3011_group和 Candidatus_Soleaferrea两种菌群较对照组显著减少。
我们还发现，母猪粪便中的相对丰度比表现出显著的阶段特异性表型。例如，在门水平上，厚壁菌门的丰度从G60显著增加到L7。同时，拟杆菌的数量从G60下降到L7。
3.3.2 仔猪粪便微生物区系
表4：L0和L7仔猪粪便α多样性值
添加FFM，L0和L7仔猪的α多样性(表4)无显著差异(p>0.0 5)。PCoA结果(图4b)显示了仔猪的细菌群落，它们在L0和L7处明显分离且都没有明显的分组。总体而言，母猪饲喂CON和FFM日粮的仔猪样品之间的距离显示出高度相似的细菌组成。
表5：L0仔猪粪便微生物区系在门、属水平上的组成
如表5所示，在L0和L7比较了饲喂CON和FFM母猪其后代仔猪的粪便微生物群组成的差异。
L0时期的优势门是厚壁菌门、放线菌门和变形菌门，占各处理组各时期总类群的90%以上。各处理组间差异不显著。在厚壁菌门中，FFM仔猪粪便中unclassized-f_Lachnospiraceae属的相对丰度显著高于CON组仔猪(p=0.03，q>0.05）。
表6：L7仔猪粪便微生物区系在门、属水平上的组成
L7时期(表6)，优势门是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门，占总类群的90%以上，各处理组之间无明显差异。在厚壁菌门中，FFM仔猪粪便中norank_f_Ruminococcaceae的相对丰度显著高于CON仔猪(p = 0.046, q > 0.05)。
同样，对于母猪，我们也发现仔猪粪便中的相对丰度比具有显著的阶段特异性。例如，在门水平上，厚壁菌门(CON = 76.12±3.92%和FFM = 62.82±11.74%)的丰度从L0减少到L7(CON = 59.38±5.81%和FFM = 58.83±7.06%)，而拟杆菌门(CON = 0.99±0.23%和FFM = 2.71±1.46%)的丰度从L0增加到L7(CON=59.38±5.81%，FFM=58.83±7.06%)。
3.3.3 G60粪便微生物群落功能变化预测
表7：主要的微生物途径被分为3级KEGG功能类别
G60粪便微生物群落的功能预测变化结果表明，只有碳水化合物和脂质代谢相关的微生物群落的功能受到双向补充的显著影响（表7）。表中列出了与碳水化合物代谢有关的七大途径。FFM组显示出显著的高水平基因和基因组途径“糖酵解/糖异生”和“柠檬酸循环（TCA循环）代谢”（p< 0.05）以及更高显著的KEGG途径“戊糖和葡萄糖醛酸相互转化”和“果糖和甘露糖代谢”（p < 0.05）。FFM组涉及脂代谢的前七条途径中有三条增加:“脂肪酸生物合成”、“脂肪酸延长”和“次生胆汁酸生物合成”（p< 0.05）。相比之下，只有“酮体的合成和降解”途径减少（p< 0.05）。与氨基酸或能量代谢相关的途径在试验组间无显著差异（p> 0.05）。
4、结论
数据表明，FFM是一个低成本的纤维资源，可以调控微生物群落。在妊娠期日粮中添加FFM是提高母猪妊娠期限饲性能的好方法。最显著的好处是提高母猪妊娠期和哺乳期的采食量，减少母猪妊娠期和哺乳期的便秘，降低仔猪的腹泻率，对提高母猪的生产性能有积极的影响。这些有益效果的机制可能主要通过调节母猪及其后代的肠道微生物群来实现，而不是通过调节血清和葡萄糖代谢相关激素来实现。此外，母猪妊娠期添加FFM引起的微生物群改变可以持续到泌乳早期，提供更多样的微生物以改善肠道健康和减轻有害微生物对环境的影响。此外，通过转移母体微生物区系，使仔猪的腹泻率较低，哺乳期生长较快。纤维日粮对母猪及其后代肠道微生物区系的长期有益作用以及微生物区系与母猪生产性能的相互作用机制有待于进一步研究。
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